目录：
一、前言
二、细胞计数仪原理
1. 手动计数与自动计数
2. 自动细胞计数原理
三、细胞计数仪评价标准
四、细胞计数仪选择方法
一、前言
细胞计数是一种确定样品中细胞的绝对数量或细胞密度的测量方法；并且是构成稳定细胞培养、精确细胞实验以及精准定量的基础。无论是为转染准备细胞，还是为实验接种精确数量的细胞，细胞计数以及活力分析都是许多实验应用的基础。
当我们在研究疾病进展以及药物或调节剂如何影响我们的健康时，细胞计数的一致性以及准确性就显得尤为重要。虽然许多小型实验室仍在使用手动计数的方法，但一些大型实验室已经开始使用自动化系统，来实现无缝的质量控制和细胞处理，同时保持对下游实验至关重要的精确度。
本篇文章能够为您提供有效的方法和专业的视角，以及基于应用的案例研究，帮助您选择一种适合您实验的细胞计数仪。
二、细胞计数仪原理
目前，细胞计数方法分为手动计数和自动计数两种， 自动计数的仪器多种多样，大致分为三种方法。下文将对目前市面上不同的计数原理进行概述，供大家详细参考。
1.手动计数和自动计数
（1）手动计数
常用的手动计数方法是使用血球计数板计数，此方法起初是为分析血液样本而开发的。一直以来，细胞生物学家都使用它来进行细胞计数，血球计数板在载玻片上带有计数室以及Neubauer计数网格，通过移液管将样本加入计数室，然后在显微镜下直接观察细胞进行细胞计数。
这种方法的优点是初始以及维护成本低，但主要缺点包括：
（2）自动计数
自动细胞计数仪的功能各不相同，但都基于三种主要技术：
自动细胞计数仪不仅适用于哺乳动物细胞与原代细胞，也适用于酵母、藻类和原生动物等尺寸较小的细胞。与手动计数相比，自动细胞计数仪的优势包括：
自动细胞计数仪还有许多其他优点，如易于操作的界面：可以评估细胞形状与测量细胞大小，来确认细胞类型特征。
2.自动细胞计数方法
在本章节将会讲述自动细胞计数的三种方法以及各自的优缺点。
(1)电阻抗计数法
电阻抗是利用库尔特原理对细胞进行计数。首先需要将细胞悬浮在弱电解质溶液中，然后将该溶液通过直径精确的小孔，通过施加小电压，从而形成一个“感应区”，当每个细胞通过孔道时，都会置换出与自身体积相等的电解质溶液，这种置换将产生电压脉冲，该电压脉冲代表细胞数量，可对其进行监测；较大的细胞会产生更大振幅的脉冲，因此脉冲高度与细胞大小成正比。所以样品中细胞浓度是通过精确控制和测量通过孔的液体体积来确定的。
与光学计数相比，库尔特计数法不受细胞颜色或折射率的影响，能够计数样品中存在的所有颗粒。如Multisizer 4e细胞计数仪，能精确计数细胞的数量以及大小。
电阻抗计数法的优势在于，与手工计数相比，该方法提升了计数的精确度与速度，但它不能进行活细胞/死细胞的分析，无法得出细胞存活率，且不能精确计数成团的细胞。
（2）基于图像的细胞计数
细胞成像技术的进步使得基于图像的细胞计数仪迅速发展。这些系统使用与手动计数相同的原理，但通常操作更为简便，并可以提供细胞形状和大小的信息。操作流程是将样本加入一次性计数板的腔室，调整预设的参数并进行计数。
细胞计数是通过无标记分析、细胞染色或荧光测量实现的，光学模式有明场、单色荧光或双色荧光。这些自动细胞计数仪可以测量各种细胞类型和细胞密度，并且通常具有一系列附加功能，包括参数设置、细胞阀门大小、自动聚焦以及数据存储和记录。他们主要是对单视野进行拍照计数，但近期研发的自动细胞计数仪可以拍摄多张视野图像进行计数，以提高细胞计数的精度。
基于图像的细胞计数有众多优势：
但基于图像的细胞计数却难以计数低浓度的细胞。
（3）流式细胞术
虽然流式细胞术提供了对细胞特性的快速定量，但在细胞计数时需要先确定细胞浓度，或者使用额外的计数标准。因此，复杂性和高成本可能会对小型实验室造成障碍。
然而，该技术可以在异质混合细胞群中有效地分选细胞，所以可以用于计数原代细胞。使用特定体积的已知浓度的荧光微珠，将其添加到一个特定的样品体积来创建一个已知的比例，然后通过测量被记录的荧光微珠的数量来换算样品的体积，从而得到细胞的绝对数量。
基于图像的流式细胞术，可以在一个系统中定义多个参数，是一种非常强大的细胞表征和分析工具，但同时也代表着昂贵的费用以及繁琐且专业的操作，现今的实验室很少单纯地将流式细胞术用于细胞计数，往往会用流式去做定性或定量分析细胞功能与分选细胞。
三、计数仪评价标准
市面上的细胞计数仪多种多样，大家对各品牌的计数仪也褒贬不一，那么我们该如何客观地评价一款细胞计数仪呢？这就需要参考细胞计数仪的计数标准。
仪器行业的发展推动了各种细胞计数仪的发展，并广泛地应用于总细胞计数和分类细胞计数。在缺乏参考资料的情况下，测量方法的准确性很难确定。同时生物制剂的复杂性（如细胞类型、来源、制备等）也使这一问题更加突出。因此在没有参照材料或参照方法的情况下，需要制定措施来保证细胞计数测量过程中的质量。
本文提供了一种通过稀释系列实验设计和统计分析得出的一组质量指标来评估细胞计数的方法。该方法适用于总细胞计数、细胞分类计数、直接细胞计数和间接细胞计数，前提是测量过程符合实验设计的标准（例如，将细胞应为悬浮状态），且该方法主要适用于真核细胞。
在细胞计数中获得高置信度意味着测量既准确又精确。具体来说，通过实验设计和统计分析，可以评估描述偏离比例和变异系数（CV）的质量指标，以评估细胞计数测量过程的质量。质量指标评估细胞计数测量过程的整体质量，其中测量过程包括样品制备和处理、数据采集以及数据处理/校正。
1. 样品制备
测试材料应为悬浮细胞，且细胞应为单细胞、细胞聚集体或细胞团聚体。
用于为细胞计数测量过程生成代表性测试样本的制备和处理程序应进行优化，以保持测试样本的特性。
样品制备程序应避免对细胞造成损伤，防止改变其计数能力，并避免引入/减少可干扰或人为改善细胞计数测量过程的碎片。
2. 稀释分数实验设计
使用一个细胞悬液作为母液，在预期浓度范围内稀释为不同浓度的可重复代表性测试样本，如果浓度和组成完全相同，则可以使用额外的细胞原液。
注：该图描述了从单一细胞悬液开始的实验设计，其中通过独立稀释得到一组包含3个重复代表性样本（n=3）的稀释分数。对每个代表性样本进行三次重复计数
i表示细胞原液不同稀释分数的数量（i=1，.....，i）；dfi表示不同的稀释分数，值在0至1之间；ni表示为目标稀释分数的具有代表性的重复测试样本数；kij表示第i个稀释分数的第j样本的重复测量次数；Yijk表示来自细胞原液的第i个目标稀释分数的第j个重复代表性样本的第k个重复计数样本的值。
统计方法
在该细胞计数标准中，统计学分析过程如下图：
统计学分析过程
由该图可得需计算四项指标：
①细胞计数平均值（Ydfi）
细胞计数平均值（Ydfi）表示目标稀释分数df的一组测试样本的细胞计数平均值
其中Yij表示df的第j个代表性测试样本的K个重复计数值的平均值，由以下公式得出：
②变异系数（CV）
变异系数（CV）是衡量各观测值变异程度的统计量。样本测量精度应使用重复性测量值的变异系数（CV）进行评估，用百分比（%CV）表示。CV值越小，表示数据越稳定，变异程度越小，反之则表示数据不稳定，变异程度较大。
CVij表示具有目标稀释分数df的代表性测试样品j的重复性观测数值的变异系数。
%CVdfi表示具有目标稀释分数df的一组n个代表性测试样品的变异系数平均百分比。
③决定系数（R2）
决定系数R2是在数据分析和实验设计领域广泛使用的指标，用于描述模型与一组观测值的拟合程度。
其中，Y......是一组 n 个具有代表性的独立测试样本 j 的 Yij 的平均值；一组目标稀释分数 (DF) 的重复代表性测试样本的 Yij 的平均值由公式给出：
④比例指数（PI）
用户应根据平滑残差计算比例指数（PI）。
用户应根据细胞计数测量的预期用途选择PI的计算方法。
3. 结果报告
细胞计数应以细胞浓度表示，单位为细胞/ml。
报告应包含以下质量指标:
五、细胞计数仪选择方法
我们面对各种品牌，如何为自己的实验室选择合适的细胞计数仪呢？
虽然一些自动细胞计数仪（如流式细胞仪）的设备初始成本高，方案复杂，但是只要您的实验室选择合适的自动细胞计数仪将为以后的实验带来巨大的方便。
在选择仪器之前，我们需要确定影响计数方法选择的重要因素：样本类型。样本类型决定了我们使用何种染色方法能更准确地得到细胞的数量、细胞的存活率。
样本类型
实验室的细胞类型一般多为常规传代培养的细胞系，如肿瘤细胞系、哺乳动物细胞系等，这些细胞的直径通常在5-40μm。这类型的细胞计数往往简单易操作。
从组织或血液中分离的原代细胞，如PBMC、脾细胞等，但由于细胞碎片频繁存在、细胞随时间降解以及消化细胞悬液中的细胞群异质性，准确测定细胞数是富有挑战的。
除细胞系与原代细胞外，也有一些别的样本类型的计数需求，如酵母细胞、球藻细胞、芽孢杆菌等小粒径样本（1-10μm）。
我们需要根据细胞类型选择合适的自动细胞计数仪：
明场与荧光计数对比表格
计数仪基本的要求是计数的准确性以及计数速度，所以下文详细列出了各个产品的特性，有助于您选择合适的计数仪设备。
计数仪准确性、稳定性
选择自动细胞计数仪代替手工计数，计数仪结果的准确性和稳定性至关重要。
准确性是计数仪计数结果与真实值之间的差异，可以与手工计数结果对比，或者借助标准品进行验证计数仪准确性。稳定性是对同一样本多次测量后的结果偏差在可允许范围内，可用CV值（变异系数）表示。一台优秀的计数仪，通常CV值＜5%。
检测效率
当选择适合自己实验室的计数仪时，除了考虑样本、准确性与稳定性之外，检测效率也是十分值得关注的一个因素。手动计数的一个缺点是耗时耗力，那么自动计数仪逐渐替代手动计数的一大优势——省时省力，便是通过检测效率来评估。一台计数仪不仅要做到计数准确与稳定，快速也很重要。
检测效率的评估主要通过单个样本检测时间与检测通量评定。通常一个样本，手动计数的时间约为3-5min，计数仪在10s-2min时间不等，并且检测时间也会受到聚焦方式的影响。一块血球计数板有两个计数槽，现在市面上的大多数自动细胞计数仪也采用的两通道计数板；也有一些高通量的细胞计数仪，适用于当一天需要检测的样本数量巨大时。
下表汇总了我司现有计数仪的检测效率，您可以根据自己的需求进行选择。
21 CFR Part 11
在FDA 21 CFR Part 11 规定中，仪器设备的电子记录被认为具有与书面记录和手写签名等同的效力，此法规确保了电子数据的有效性和可靠性。在生物制造行业，质量控制和数据管理功能可以提供一个方便的方法来跟踪多个细胞批次和监测不同的细胞操作安全。
所以计数仪是否符合 21 CFR Part 11的规定也作为计数仪选择的一个补充参考。
其他因素
除以上所列条目外，还有一些因素也值得考虑，如是否需要外接电脑、性价比、服务等方面。
①机型——自动细胞计数仪产品除高通量计数仪 HT与HT FL需要外接电脑外，其余设备均为一体机，自带触控屏，无需配备电脑便可进行计数操作，且设备体积较小，无需占据实验室内部很大的空间，放置于桌面上便可通过触控屏点击操作，得到准确的计数结果。
②细胞阀门——许多自动细胞计数仪能够根据细胞的大小、形状、亮度等参数调节，然后从计数范围内排除不需要的细胞。这一调节能够为特定的下游应用选择细胞，从计数中去除样品碎片，以及在有多种细胞类型的样品中识别单个细胞类型。为了便于使用，许多自动细胞计数仪还具有“配置文件存储”功能，允许用户保存已自定义好的参数阈值，以便下一次直接使用该参数进行计数，节省时间。
③成团细胞计数——虽然应该采取一切措施来确保样品准备得当，但还是有细胞成团/聚集的可能性，并且细胞成团可能影响细胞的计数。自动细胞计数仪使用内置的算法能提高对成团细胞计数的准确性。
④性价比——仪器本身的价格会受到计数原理、计数通量、预设调整等配置的影响，荧光计数的价格高于明场计数；计数通量越高那么价格也会越高；此外，还需考虑到耗材的成本以及后续仪器维护的成本，我司的计数仪耗材均使用一体压成的工艺，更能保证计数的准确性；使用流式以及库尔特计数原理的计数仪都需进行定期的维护，因此仪器后续的维护费用也是需要考虑的因素之一。
⑤服务——服务包括售前售后、仪器试用、技术支持以及质保期。奎克泰生物会为您持续提供高效专业的服务。
了解以上的内容后，相信无论是需要原代细胞计数还是细胞系计数、明场还是荧光、常规通量还是高通量，我司具有极高性价比与专业服务保障的产品，会有一款能满足您的需求。
