1、聚合酶关键词：RT-PCR 逆转录酶 reversetranscriptase链式反应引物设计DNA聚合酶、知识背景:1、基因表达：DNA RNA P rotein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白mRN(每个mRNA存活4d,可以合成105个丝心蛋白)共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。2、PCR 技术(olymerase chain reaction):即聚合酶链式 反应。在模板、引物和四种脫氧核昔酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决 定。反应分三步：A、变性：
2、通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA 退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结 合。C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2+存在下，退火引物 沿5 3方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶(reverse transcriptase )是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第条链；2、Rnase水解活性：水解RNANA杂合体中的RNA 3、依赖DNA的 DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的准备：
3、1、引物的设计及其原则：1)引物的特异性决定PCR反应特异性。 因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑 到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNAI切方 式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达 过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括a、引物长度：一般为1530bp,引物太短会影响PCR的特 异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温 度，也影响反应的特异性。b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免卩票吟或卩密咗的聚集存在，
4、特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40%60%, PCR扩增的复性温度一般是较低Tm 值减去510度。c、3端要求：3,端必须与模板严格互补，不能进行任何修 饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是 A时错 配的引发效率最低，G C居中间，因此引物的3端最好选用力G C而尽可能避免连续出现两个以上的Tod、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续 碱基互补，3,端不应超过2个。f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8 个的互补碱基存在。g、5端无严格限制：5
5、末端碱基可以游离，但最好是G或C使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位 点寺）寺寺。根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如，等对 于这些 条件都可以自行设置。2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过%DE P水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPCo3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酉精、经DEPC处理并高压的水。、RNA勺提取方法：RT- PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RN
6、A酶活 性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA寸，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是釆用焦碳酸二乙酯（DEPC去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氤酸月瓜抑制内源性RNA酶。实验操作步骤、实验器具与材料：1、移液枪：1ml、200 卩 1、20 卩 1、10 卩 1、2 卩 12、吸头：1ml、200 卩 I、20 卩 13、匀浆管：5ml4、吸头台:放置lml吸头的一个，放置20 1吸头的一个5、EP 管：、100 卩 16、试剂瓶：2个60m
7、l的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒:50ml、250ml、500ml&容量瓶：250ml 500ml 1000ml9、试管架：5ml.、20 110、盐水瓶：250ml. 500ml各2个备用，一个装无水乙醇,另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒:13、大瓷缸：2个14、锡泊纸：15、卷纸：2卷16、三角烧瓶：带盖，稍大、实验器具的处理与准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压， 再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再
8、咼压一次（管）EP2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1%。DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包 括剪刀、蹑子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC、试剂配制：放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1%DEPC水,2、75%乙醇：用无水乙醇DEPC水配，然后放-20 C保存（其 i=EPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制：1、电泳缓冲液：Tris_54g硼酸EDTA 20ml ?蒸溜水 1000ml5XTBE （贮存液）再将5X TBE稀释10
9、倍成就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液450ml水一500ml Z作缓冲液2、上样缓冲液:%二甲苯青FF 30%甘油 6X缓冲液，4C保存五、琼脂糖凝胶的配制：1、%琼脂糖100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60 C时加入10mg/ml漠化乙锭 卩1,充分混 匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。2、%:同上，将琼脂糖的量改为六、需购置的RT-PCR材料：（生工.Tel. 2236106.）Taq 酶（含 MgCI2 Buffer ） 200udNT P: 1 支Oligo (dT) 15: 1 0D
10、p romegaM-MLV: 1 支 p romega (Buffer)RNasin: 1 支 11020 CDEPC 5gTrizol 100ml/l 瓶 Invitrogen Life technologies4CMarker: 10 Pg 卩 g/ml 科威(1543. 994. 697. 515. 377. 231七、引物合成 正义：5, -CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC- 反义：5 -TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT- 2、p ar-4: 正义：5 -GGGACCTCGGAACTCAAC-反义：5 -TGTATCTGCCTGGGACTG-3、退火温度
11、计算2 (A T) 4 ( G C)正反义平均数，再上下波动度（土 4C,或土 504、引物各合成5 0D,每0D瓶分装好5、引物稀释:力n DEPC水量为二？ nmol / 0D X 管上所标 0D 数 X 100是为10p mol /卩1浓度的引物溶液八、PCR产物电泳 先将1-10卩1左右PCR产物，加已点在纸上 的漠酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA电源100V,电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。九、几个注意点：1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。felW 删I拋总持蔚离心机预冷。细胞IX 107组织100mg加 lmlT
12、RIzol细胞用lnil加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆（要彻底，后转至EP管）（组织匀浆量100mg时分装lml/每EP管）颠倒混匀10下，室温5分钟颠倒混匀10加氯仿1/5体积（）（必须按总体积的1/5 ） 下，室温5分钟4C,离心12000g, 15分钟转上层水相（约400卩I ）于另一管中加等体积异丙醇（约400卩I ）,混匀室温10分钟4C,离心12000g, 10分钟弃上清加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml4C离心7500g, 5分钟弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥） 溶于DEPC水中至20卩I （10卩1-20卩I ）（可在55-60 C水中，V10分钟助溶
13、）注:1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则 DEPC 溶解2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60 C放置至少一个月 甚至可一年以上）3、RNA在75%乙醇中，2-8 C至少可保存一周，-20 C至少可 保存一年 两步法RT-PCR第一步：逆转录反应）试剂浓度体积终浓度RNA 23 卩 I 卩 I）Oligo（dT）15 卩 g/ 卩 I 4 卩 1（2 卩 I）卩 g/ 卩 1稀释10倍后用）混匀，离心，70 C 5min立即冰水浴，稍离心试剂浓度体积终浓度M-MLV Buffer 5 X dNT P lOmM 孙（1RNasin 40U/ 卩 I 1M-MLV 200U/u 1 2 200U卩1 （1卩1）总体积40卩1（20卩1 ）混匀,离心，42 C 60min95C lOmin （破坏 MLV4C保存两步法RT-PCR(第二步：PCR反应)总体积20卩1 (50卩I)试剂浓度体积终浓度Taq Buffer 10 x 2 卩 I (5 卩1 XMgCI2 25mM 卩 I (3 卩 I)dNTP lOmM 卩 I 卩 I) 200uMI) lOpmollOpmol上游引物lOpmol/卩I卩I (1卩F 游引物 lOpmol/ 卩 I al (lai)cDNA 模板 X (?) (1- 10a I)DEPC 水 20 aal -X
